Nyelv :
SWEWE Tag :Bejelentkezés |Bejegyzés
Keresés
Enciklopédia közösség |Enciklopédia válaszok |Küldje el kérdését |Szókincs |Feltöltés ismeretek
Előző 1 Következő Válassza ki a Pages

Didezoxi

Hogy meghatározzuk a nukleotid szekvenciáját nukleinsav módszer. Az elkülönítés a egyszálú formája a nukleotid után a DNS hibridizáció, valamint a dezoxiribonukleotid és a 2 ', 3'-didezoxi-nukleotidok keverékével a jelenléte a DNS polimeráz inkubáltuk romlandó .

Didezoxi szekvenálás

Rövid bevezetés

Az egész folyamat a DNS-polimeráz felhasználásával két tulajdonsággal: (1) szintézise egyszálú DNS-templát komplementer másolat lehet, (2), hogy a 2 ', 3'-didezoxi-nukleozid-trifoszfátok szubsztrátokkal. Egyszer, amikor az analóg van beépítve, ahol hiányzik a 3'-terminális hidroxil-csoport már nem szükséges a lánc nyúlása a szubsztrát, úgy, hogy a nyúlás a DNS-lánc terminációs. A gyakorlatban, a használata Ke Lunnuo fragmensének DNS-polimeráz I (Klenow-fragmentum) alkalmazva, az enzim, amelyből hiányzik a teljes 5 ', 3'-exonukleáz aktivitását. DNS-szintézis a négy dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében, amely egy vagy több, a 32P-vel jelölt, négyet mindegyik reakcióelegy tartalmaz egy didezoxi cikke. Amikor a reakció befejeződött, a reakcióelegyet minden reakcióban egy sor, az új DNS-fragmens 5'-végén az azonos, de különböző hosszúságú és bázis - 3'-végén a megszüntetése egy adott . Ezeket a keverékeket lehet elválasztani elektroforézissel autoradiográfia (ray trace módszer jelentősen) teszi láthatóvá, és olvassa el a sorrend.1980 miatt a tervezés ilyen megállapítást Sanger DNS (dezoxiribonukleinsav) belül, a nukleotidszekvencia a módszer és a W · Gilbert, P · Berg az 1980 megosztott kémiai Nobel-díjat.

Alapelv

DNS replikáció általában megköveteli: DNS polimeráz, egyszálú DNS-templát, a 3'-OH végéhez az egyszálú oligonukleotid primerek, négyféle dNTP (dATP, dGTP, dTTP és dCTP). Polimeráz a sablon segítségével, mint egy útmutató, a dNTP folyamatosan adagoljuk primer 3'-OH végén a primer extenziós szintézisét egy új DNS-szál komplementer. Ha felvesz egy adott nukleotid, didezoxinukleotid-trifoszfát (ddNTP), mert ez eltér a szokásos dNTP dezoxiribóz 3 'helyzetben a hiányzó hidroxilcsoport, ez nem a későbbi kialakulását egy foszfodiészter kötést dNTP. Például vannak ddCTP, dCTP, és három másik dNTP (amelyek közül az egyik α-32P jelzett) abban az esetben, a primer, sablon, és inkubáljuk DNS-polimeráz, egy egészet alkotnak ugyanazzal a primer 5'- end és ddC maradványok a 3 'végén a végén egy sorozat keverékei különböző hosszúságú fragmensek. Denaturáló poliakrilamid-gél-elektroforézissel autoradiogram kapott spektrumokat az új zóna szintetizált DNS láncok különböző hosszúságú, hogy pontos információkat nyújt a C-eloszlása, úgy, hogy a helyzetét az összes C meghatározva. Hasonló módon eljárva, ddATP, ddTTP és ddGTP jelenlétében, illetve egyidejűleg lehet beszerezni ddA, DDG-t és DDT-maradékok, a 3 'vége a fej végén a három különböző fragmentumok rövid. A kapott keverék mind a négy párhuzamos hely hozzáadva a savas denaturáló poliakrilamid gélelektroforézis tábla az egyes csoportok esetében a termékek a megfelelő komponensek eltérő lesz aszerint, hogy azok lánc hosszát el kell különíteni, így kapjuk a megfelelő autoradiogramon Atlas. Közvetlenül leolvasható a kapott spektrumok DNS bázispár sorozatot.

Rövid bevezetés

Megszüntetése a jelenlegi jogi és kivonás logika szekvenáló technológia (Sacger és Coulson, 1975) alakult ki. Kivonás először a specifikus primerek használatával az intézkedés alapján a DNS-polimeráz extenziós reakcióban, bázis-specifikus lánc-terminációs, és a használata poliakrilamid gélen megkülönböztetik az egyik különbség nukleotid hosszúságú egyszálú DAN háromféle módszerekkel. Annak ellenére, hogy ezeket az előlegeket, kivonás még mindig túl pontatlan és túl nem törvény, nehéz széles körben elfogadott. Amíg a bevezetése dioxigén trifoszfátok (ddTBP), mint a lánc-terminátor ágens (Sanger és mtsai., 1977), DNS-szekvenálás előtt enzimes technológiát már széles körben alkalmazzák. 2 ', a közönséges 3'ddNTP különböző dNTP dezoxiribóz azok 3' helyzetben a hiányzó hidroxilcsoport. Lehetnek az intézkedés révén a DNS-polimeráz 5'-trifoszfát-csoport beépítése a növekvő DNS-lánc, de nincs 3 'hidroxilcsoport, akkor a későbbi kialakulását egy foszfodiészter-lánc dNTP, ezért egyre DNS szálak nem is terjed. Tehát a DNS szintézis reakció keveréket a négy dNTP-általános kis mennyiségű egy ddNTP után adjuk hozzá a járulékos lánchosszabbítás de nagyon specifikus lánc terminációs versenyez, a reakció terméke egy sor nukleotid-lánc, a hossza DNS-szintézis alapján kerül meghatározásra, hogy a kezdetektől a végén egy primer idő előtti megszűnése lánc közötti távolság a pozíció. Négy független enzimreakciót alkalmaztuk négy ddNTP különböző, az eredmény fog négy oligonukleotid, amely megszünteti a templát szálát minden egyes A, G vagy T minden egyes helyzetben.

Sanger módszer reagensek

Primer

Enzimatikus szekvenálási reakciók segítségével egy adott szekvencia komplementer a templát szál szintetikus oligonukleotid primereket a DNS-szintézist. Sok esetben, a cél-DNS-fragmens lehet klónozva M13 fág-vagy fagemid vektorba, hogy megkapjuk egyszálú DNS molekulát templátként. De lehet megállapodni a Sanger módszerrel denaturált kétszálú DNS templát szekvenciával. Mindkét esetben, lehet használni a cél DNS-t a vektorba szekvenciákat szegélyező primerek lágyítás fázisban, ahelyett, hogy megkapjuk a ismeretlen DNS-szekvencia komplementer primerrel. Rekombináns M13 fág klónokat alkalmas univerzális szekvenáló primerek általában 15-29 nukleotid hosszúságú, és a szoros M13mp18 fág kiónozó régióban Hind Ⅲ helyén M13mp19 bakteriofág klónozási helyek EcoRI helyére a régió komplementer a szekvenciával . Ezek az alapozók is használható plazmid DNS klónozott pUC a "duplex" szekvenálás, megvásárolható számos gyártó. Ezen túlmenően, számos cég eladni néhány primerek alapján ezek a primerek által a különböző restrikciós helyek a klónozás a különböző helyszíneken a cél-DNS-szekvenálás plazmid és a design.

Sablon

Mint a fentiekben leírtuk, két típusú DNS lehet használni, mint egy sablont a szekvenálás Sanger módszerrel: a tiszta egyszálú DNS-t és után hődenaturációs vagy lúggal denaturált kétszálú DNS-t. A szokásos részecskék származó rekombináns M13 fág egyszálú DNS-t izoláltuk kell kap több száz nukleotid. Használata esetén denaturált kétszálú DNS-t egy sablont, nehéz beszerezni minőségi eredményeket Zan. Annak ellenére, hogy a kettős szálú DNS-templát megközelítés nyilvánvalóan egyszerre egyszerű és kényelmes (Chen és Seeburg, 1985), de csak a közelmúltban javult a jövőben,

Ezt a módszert fejlesztették ki, hogy tudja, hogy világos és hiteles eredmény szinten. Vannak két tényező, amelyek elengedhetetlenek, hogy a minősége a templát DNS-t és a DNS-polimeráz típusa használni. A plazmid DNS-t a kis készült rostély oligodezoxiribonukleotidok gyakran kis molekulák, a nukleáris és szennyeződés glükuronid inhibitorai a DNS-polimeráz, az első két szennyező lehet használni, mint primerek alkalmazásával. Eredmény, a "szellem" zenekar, erős megszüntetése jelenségek, valamint egyéb leletek inkább, hogy a szekvenálás gél homályos háttérbe szorította. Éppen ezért, ha egy plazmid miniprep NDA hogy meghatározzák az ismeretlen DNS-szekvenciáját a klónozott fragmens, és nem kívánatos. Azonban az ilyen DNS-t, amely már gyakran használják a szekvencia által meghatározott egy másik módszer, amely alkalmas további sablonokat. Segítségével CsCl-etídium-bromid egyensúlyi centrifugálással megtisztítani plazmid DNS szekvenálás eredményeit lesz sokkal jobb, de meg kell tölteni egy csomó humán szolgáltatások és anyagi erőforrások. Mindegyik templátszál A, G, T vagy mindegyik minden helyzetben.

DNS-polimeráz

DNS-polimeráz

Töredék az E. coli DNS-polimeráz IKlenow

Ez az enzim az első enzim létrehozásához használt a Sanger módszerrel még mindig széles körben használják, hogy meghatározzuk a DNS-szekvencia az enzim. Általában találkozás két problémát:

1) Koenow fragmens tovább képes szintetizálni alacsony, hogy néhány, a fragmentumok nem köszönhető, hogy a beépítése dd NTP, hanem azért, mert a polimer sav disszociációs emberek véletlenszerűen a sablon szintézise megszűnik, ami növeli a háttérben. Mivel az enzim nem lehet sokáig a távolban a sablon mentén mozog, hogy kihasználják az enzim normál szekvenáló reakciók miatt sorozat hossza korlátozott. Jellemzően ez a reakció csak akkor kap mintegy 250-350 nukleotid. Ha a reakciót két lépésben, megduplázhatja a szekvenciák száma szerezhetők be; ahol az első szakaszban a kezdeti címkézési lépés, a használt alacsony koncentrációjú dNTP-ből, és az azt követő második lépés lánchosszabbított - láncterminációs reakciót, és nagy koncentrációban tartalmazó ddNTP A dNTP (Johoston Dow-, stb, 1987; Stambaugh és Blakesley, 1988). Azonban még ezek a fejlesztések, mért Klenow szekvencia hossza általában nem olyan jó, mint legutóbb szintézisének képessége szekvenálás enzimeket.

2) az enzim a sablon polinukleotid szegmens erős másodlagos szerkezettel, vagy más területen tartalmú replikáció hatékonysága alacsony. A polimerizációs hőmérséklet-ra emeljük 55 ℃, lehet enyhíteni, de ez nem oldja meg teljesen a problémát (és Firtel Gomer, 1985). Néha egyes dNTP analógokat lehet [mint dlTP vagy 7 - nitrogén-dGTP (7-deaza-dGTP)], így a sablon formában stabil másodlagos szerkezetét a szekvencia információ a megfelelő szakaszban, de ezek analógjai enzimek Kleow szerepet Sequenase hatékony lehet, mert van egy kisebb plazminogén hogy Klenow folyamatos szintézis tovább csökken.

Általános jelen, akkor a töredék az E. coli DNS-polimeráz IKlenow mért primer 5 'helyzetben 250 nukleotid egy DNS-szekvencia, de nem használják többé, hogy meghatározzák a DNS-szekvencia vagy kettős szimmetria és (vagy ) egy DNS-polinukleotid-szekvencia szegmensben.

Fordított transzkriptáz

Bár nem széles körben használják a rutin szekvenciáló reverz transzkriptáz, de néha használják, hogy megoldja néhány ez az enzim jelenlétében DNS templátként A / T, vagy G / C régió polinukleotid felmerülő problémákat. Madarak és rágcsálók a retrovírus reverz transzkriptáz ebben a véleményben valamivel jobb, mint a Klenow enzim (Karanthaansis, 1982 Graham és mtsai, 1986

), Bár talán kevésbé, mint Sequenase (Cameron-Mills, 1988, Revák, stb 1988).

Sequenase

Sequenase (Sequenase) egy kémiailag módosított bakteriofág T7 DNS-polimeráz. Ez az enzim erős volt 3 '→ 5' exonukleáz aktivitás, a módosítás után, a legtöbb e tevékenység megszűnt. Sequenase Version 2.0 Sequenase terméke volt, a géntechnológia, ez teljesen hiányzik a 3 '→ 5' exonukleáz aktivitás, rendkívül stabil és kémiailag módosított aktívabb, mint 2-szer magasabb enzimatikus szekvenálással. Sequenase továbbra is erős képes szintetizálni a polimerizáció arány nagyon magas, az ilyen dlTP és 7 - nitrogén-dGTP és más molekulák, amely javítja a felbontás a szekvenáló gél tömörítés egyes szakaszain lehet elválasztani sávok hasonló nukleotid anyagának széles tolerancia. Ez a meghatározás az előnyös DNS-szekvencia hossza enzimet. Sequenase mozoghat mentén távolsági a sablon, és így a reakció lehet mérni gyakran több száz DNS nukleotid szekvenciákat. Tény, hogy a mért hossza a szekvenciát jobban érintette felbontási képessége alapján poliakrilamid gélek, nem vonatkoznak a megszorítások jellemzőinek a polimeráz. Hogy kihasználják a nagy Sequenase processzivitása, lehet egy kétlépéses reakció sorozat. Az első lépés az alacsony dNTP-koncentráció alacsonyabb hőmérsékletű, oly módon, hogy korlátozza a szintézis reakció alatt mérsékelt, és hogy radioaktívan jelzett dNTP és alacsonyabb hőmérsékleten annak érdekében, hogy korlátozza a szintézis reakció alatt mérsékelt, és hogy a radioaktív izotóppal jelzett dNTP hatékony dopping ben, a reakció terméke ebben a lépésben csupán egy kiterjesztése a 20-30 primerek bázisok. Ezután az első reakció-szakaszban aliquotokat 4 Csoport 1 sor standard reakció-rendszerek, minden egyes reakció tartalmaz nagy koncentrációban dNTP és ddNTP egyike. Ahhoz, hogy a polimerizációs reakció folytatódik, amíg a kapott nukleáris láncterminációs bőr savak beépítették a lánc növekszik.

Taq DNS-polimeráz

Taq DNS polimeráz számára a meghatározása a formáció egy nagy szegmens 37 ℃ stabil szerkezet tíz egyszálú DNS-templát-szekvencia. Ez azért van, mert a Taq

DNS-polimeráz 70-75 ℃ mutatta a legnagyobb aktivitást, bár ez a hőmérséklet GC-ben gazdag sablonok is képtelenek szekunder struktúrákat alkotnak. Szerint stb 1nnis (1988) ismertet egy eljárást a szekvenáláshoz a Taq DNS-polimeráz autoradiográfiás filmre kapott egymást követő nukleotidok száz szekvenált létra sávok mindig egyértelmű, mint az egyik, hogy a folyamatos szintézise ez az enzim nagyon jó. Mindegyik templátszál A, G, T vagy mindegyik minden helyzetben. Mindegyik templátszál A, G, T vagy mindegyik minden helyzetben.


Előző 1 Következő Válassza ki a Pages
Használó Felülvizsgálati
Nincs még hozzászólás
Én is kommentálom [Látogató (3.237.*.*) | Bejelentkezés ]

Nyelv :
| Ellenőrző kód :


Keresés

版权申明 | 隐私权政策 | Szerzői jog @2018 A világ enciklopédikus tudás