| Nyelv : |
|
| Enciklopédia közösség |Enciklopédia válaszok |Küldje el kérdését |Szókincs |Feltöltés ismeretek |
Primer |
  |
|
Primer (primer), egy rövid egyszálú DNS-t vagy RNS-t, DNS-replikációt, mint a kiindulási pont, a reakció a nukleinsav szintézis, a polinukleotid lánc, mint egy kiindulási pont a munka kiterjesztése egy polinukleotid lánc, primer 3'-OH, a nukleotid láncot alkotnak a diészter szintézist, így primer 3'-OH, mentesek. Type Organizmusok jelenlétében természetes DNS-replikáció primert (primer RNS) és a polimeráz láncreakció (PCR) a szintetikus primer (rendszerintDNS primerek). Tábornok azt mondta alapozó jelenti DNS alapozók, primer továbbiakban. Primer tervezési alapelvek Két szintetikus oligonukleotid primerek szekvencia, az egyik primer egyik végén egy régió az érdeklődés DNS templát komplementer szál a másik primer, a másik végét a régió az érdeklődés olyan DNS templát komplementer szál a másik. A PCR-(polimeráz-láncreakció) technikával, egy ismert nukleotid-szekvencia a megcélzott gén primereket szintetizáltunk alapján ez a szekvencia PCR-amplifikáció a cél gén DNS olvadási hővel denaturált egyszálú be, a primer és a a megfelelő egyszálú komplementer szekvenciát, majd az intézkedés alapján a DNS-polimeráz extenziós, ismételje ciklus után a kapott terméket a nyújtás után és a primert is kombinálható. PCR primert úgy tervezték, hogy megtalálja egy pár alkalmas fragmensek nukleotid hogy hatékonyan amplifikálására templát DNS-szekvenciákat. Mint már említettük, a primer közvetlenül kapcsolódik érdemben sajátosságait PCR siker. Lehetséges pár primer célja annak biztosítása, hogy van egy catch-all szabály PCR siker, de a bizonyos elveket, segít a primer design. Legjobb beállítás terület DNS-szekvencia-összehasonlítás konzerváltak a fajok között a hasonló szekvenciákat meghatároztuk. Keresés az NCBI különböző fajok ugyanabban a gén szekvencia analízis szoftver (pl. DNAman), mint a (Alignment), ugyanabban a sorrendben az egyes gén konzervált régióiban a gént. Hossz Hossza a primereket (primer hossza) általánosan használt 18-27 bp, de nem nagyobb, mint 38, mivel a hőmérséklet túl húzódó hosszú eredményez nagyobb, mint 74 ℃, alkalmas Taq DNS polimeráz reakció. GC tartalmat Tm érték GC-tartalom (összetétel) túl magas vagy túl alacsony, nem segíti, hogy megindítja a reakciót. Upstream és a downstream primer GC tartalma nem lehet, hogy nagy különbség. Ezen túlmenően, az upstream és downstream primereket Tm értéket (olvadási hőmérséklet) az olvadási hőmérséklete az oligonukleotid, a só-koncentráció 50%-os oldatával duplex oligonukleotid lánc hőmérsékletet. Hatékony indítási hőmérséklet általában magasabb, mint a Tm érték 5 ~ 10 ℃. Ha az alábbi képlet szerint Tm = 4 (G C) 2 (A T) becsült Tm a primerek, a tényleges Tm a primerek 55 ~ 80 ℃, a Tm érték előnyösen közel 72 ℃, hogy optimális körülmények között refolding . 3 'végén, hogy elkerüljék az első három Egészítik kódoló primer 3 'végén végződő kodon nem az első három, mert az első három kodon degeneráció hajlamos, hatással lesz erősítés sajátosságait és a hatékonyságot. Válassza ki a T Primer 3 'végén egy eltérés, a hatékonysága a különböző bázisok iniciációs van egy jelentős különbség, ha az alap egy alsó, még abban az esetben az eltérés, lehet ólom szál szintézise, és amikor az alsó T eltérések lánc iniciátor hatékonysága jelentősen csökken, G, C iniciációs hatékonysága között eltérés az A, T, között úgy, hogy a 3 'végén a legjobb választás a T. A véletlenszerűen elosztott alap Primer szekvenciák belül a sablont nem lehet magasabb, hasonlóság, különösen a 3 'végén a nagy szekvencia hasonlóságot, különben könnyen vezethet a hibákat ólom (False alapozás). Alsó alapozót a sablon módszer hasonló a négy bázisok a primer előnyösen egy véletlenszerű eloszlás, nincs egy purin vagy pirimidin poli poli jelen van. Különösen a 3 'végén nem több, mint három egymást követő G vagy C, mivel ez teszi a GC-ben gazdag régió primer szekvenciát kiváltott hibákat. Kerülje a self-kiegészítő Alapozók komplementer sorozat önmagában nem létezik, vagy az alapozó is bedobja egy hajtű szerkezet (hajtű) refolding az alapozó is. Ez a másodlagos szerkezet befolyásolhatja a sztérikus gátlás következtében a primer kötő templát komplex. Alapozók önmagukban nem lehet egymást követő négy nukleotid komplementer. Sem a két komplementer primerek kell lennie, különösen kell kerülni a 3 'vége a primer komplementer átfedés, hogy megakadályozzák dimer (Dimer dimer és a Cross) képződést. Alapozók nem lehet egymást követő négy nukleotid komplementer. Hajtű primer dimer és ha elkerülhetetlen, meg kell nem túl nagy értékű △ G (kevesebb, mint 4.5kcal/mol, ΔG érték utal a kettős szálú DNS-t, így a kívánt szabad energia, ez az érték tükrözi a bázispár a kettős szálú viszonylagos stabilitás [1]), különben könnyen eredményezhet primer dimer zenekar, és csökkenti a hatékony koncentrációját a primer nem hagyja el a normál PCR reakcióban. 5 'vége a köztes értéknek magasabbnak kell lennie G 3' vége az alsó △ G érték a kettős szálú DNS-t, hogy létrehozzák a kívánt szabad energia, amely tükrözi a belső szerkezete a kettős szálú bázispár viszonylagos stabilitását, △ G nagyobb az érték, annál stabilabb duplexek. Kell kiválasztani, 5 'végén, és a közbenső △ G értéke viszonylag magas, és a 3' végén a △ G alacsony értékű (abszolút érték nem több, mint 9) primerek alkalmazásával. Primer 3 'végén a △ G érték túl magas, a mismatch oldal könnyen alkotnak egy dupla szálú DNS-szerkezet és a polimerizációs iniciátor. (A különböző helyeken △ G-értékek használhatók elemző szoftver Oligo 6) "Vége lehet módosítani Primerek 5 'végét határozza meg a hossza a PCR-terméket, csekély hatása van amplifikáció specificitását. Ezért lehet módosítani anélkül, hogy a specificitása erősítés. Primer 5 'végén módosítások közé tartozik: add restrikciós helyek; jelzett biotin, fluoreszcens, a digoxin, Eu3 , stb; bevezetése a fehérje-és DNS-szekvenciák; bevezetése pontmutációk, inszerciós mutáció, deléciós mutáns szekvencia; bevezetése egy promoter szekvenciát, és így tovább. Primer kiterjesztést a 3 'végen, és nem tud semmilyen változtatást. 3 'végén nem rendelkezik másodlagos szerkezet kialakulása lehetséges. Nincs két egyszálú struktúra Bizonyos primerek amplifikált termékek főként egy érvénytelen másodlagos szerkezete egyszálú, amplifikált fragmens kiválasztását a legjobb elkerülni a két strukturális területek. Kapcsolódó szoftverek (például a RNAstructure) nem tudja megjósolni a stabilitást mRNS másodlagos szerkezetének becslése, segít jelöljön ki egy sablont. Kísérletek azt mutatják, hogy a szabad energia, hogy kiterjesztett terület (△ ° G) kisebb, mint 58.6l kJ / mol, az amplifikáció gyakran nem sikeres. Ha nem tudja elkerülni ezen a területen, a használata a 7-deaza-2'-dezoxi-GTP helyett dGTP felerősített siker hasznos. Sajátosság |
| Használó Felülvizsgálati |
|
Nincs még hozzászólás |
