Nyelv :
SWEWE Tag :Bejelentkezés |Bejegyzés
Keresés
Enciklopédia közösség |Enciklopédia válaszok |Küldje el kérdését |Szókincs |Feltöltés ismeretek
Előző 1 Következő Válassza ki a Pages

Polimeráz láncreakció

Polimeráz láncreakció (PCR): egy in vitro DNS amplifikációs módszer. PCR polimeráz hőstabil, és két 20 bázisok álló egyszálú primert. Miután a magas hőmérséklet denaturálása a templát DNS-t választjuk szét két lánc, úgy, hogy az alacsony hőmérsékletű hőkezelés a primerek és egy egyszálú sablont, akkor a kiterjesztése a hőmérséklettől, a reakció-oldatot, majd a szabad nukleotid primereket az 5 'és 3' szintézisét egy komplementer Új láncok. Az újonnan szintetizált DNS-t, és továbbra is a hurok, így a több DNS továbbra is szaporodnak.Kísérleti célokra

Ezzel a kísérlet, hogy megtanulják az alapvető elvek PCR, az alap működését a PCR technika mestere, és agaróz gélelektroforézissel.

ELV

PCR amplifikáció ismert szekvenciák mindkét végén a DNS-szegmens, vagyis a primer meghosszabbítása által az ismétlődő DNS-szintézis utat. Alapelvek és eljárások a következők:

PCR-ciklusban, három különböző események történnek: (1) templát denaturálása, (2) primer hőkezelték; (3) a termostabil DNS polimeráz a DNS-szintézist.

1.. TS: templát DNS hevítésre, magas hőmérsékleten (94-95 ℃) denaturáló kétszálú megtörni a hidrogénkötés két egyszálú formában, a denaturálási lépést.

2.. Lágyító: a rendszer hőmérséklet-ra csökkentették a 37-65 ℃, templát DNS-t és primerek komplementer kötési által bázispárok elv, a primerek templát szálat, és a 3 'vége, amely egy részlegesen kettős szálú DNS-t, a hőkezelési lépés.

3.. Extension: rendszer reakció hőmérsékletét emeljük a hőmérséklet 72 ℃, hőálló DNS-polimeráz, hogy egyszálú DNS-t templátként, irányítása alatt a primerek, a reakcióelegyet a négy dezoxinukleotid-trifoszfát (dNTP), az 5 'és 3 "irány megismételni a komplementer DNS-t, azaz a primer terjeszkedését.

Egy ciklus a három lépés, azaz hő-denaturálás, a hőmérséklettől, a hőmérsékletet feszített három szakaszra osztható. Elméletileg minden egyes hurok révén, a DNS mennyisége a mintában meg kell kétszerezni, az újonnan alakult hurok lánc lehet egy sablon egy új kör, miután 25-30 ciklust lehet DNS amplifikálható 106-109 alkalommal ( A hat felek számára lehetővé kell 10-10, a kilencedik, a Baidu nem lehet lejátszani a tudományos jelöléssel, így írni a 106-109.)

Egy tipikus PCR-reakcióelegy összetétele az alábbi összetevőkből áll: DNS-templát, reakció puffer, dNTP-t, MgCl2, két szintetikus DNS primert, hő-DNS Taq polimeráz (Taq enzimet a Thermus aquaticus baktérium Thermus Aquaticus (Taq) ben izolált termostabil DNS polimeráz a PCR alkalmazások megvan mérföldkő jelentőségű, az enzim képes elviselni 90 ℃ feletti hőmérsékleten, és mégis élnek, nem minden ciklusban enzimet, úgy, hogy PCR-technikával már nagyon Egyszerű, hanem jelentősen csökkenti a költségeket, PCR-technológia lehet a kérelmek nagy száma, és fokozatosan alkalmazva klinikailag.).

Agaróz gél elektroforézis Alapelv

Az elv a agaróz gélelektroforézis: Agarose egy hosszú szénláncú természetes polimer molekulák forrásban lévő vízben feloldjuk, 45 ℃ kezdett kiválni merev porózus szűrőn lyukak, a gél pórusméret koncentrációjától függ az agaróz. DNS-molekulák a lúgos környezetben, negatív töltés, az alkalmazott elektromos mező a pozitív úszás. DNS-molekulák a agaróz gélen mobilitás, a töltést hatás és molekulaszűrő hatású. Különböző DNS-molekula mérete és konfigurációja eltérő elektroforetikus mobilitás, ha aránya különböző, és így különbséget tenni a különböző zónákban. Elkülönítve agaróz gélelektroforézissel DNS-t, a használata molekulaszűrő hatású, a kioldódási sebesség és fordítottan arányos a logaritmusával a molekulatömeg. Etidium bromid (EB) a lapos molekulák bocsátanak fluoreszkáló ultraibolya sugárzás. DNS-molekulák EB EB-DNS komplexek, az emissziós intenzitása a fluoreszcens emisszió, mint a szabad állapotban a fluoreszcencia intenzitását EB 10 vagy több alkalommal, és a fluoreszcencia intenzitása arányos a DNS-tartalmat. A szabad szemmel, ki lehet mutatni több mint 5 ng DNS-t.

Anyagok és reagensek

Genomi DNS-gén-specifikus primert, PCR-amplifikációs kapcsolódó reagensek, Taq enzimet

Kísérleti eljárás

1.. Extraction A DNS sablon: A kapott rizs kísérlet genomi DNS.

2.. PCR üzem (jégen):

(1) A PCR-reakcióelegy készítmény reakció rendszer 25 μ L, egy steril 0,2 ml-es centrifuga csövekbe pipettázással a következő eljárásokkal:

(2) összekeverjük a reakcióelegyet, majd minden egyes PCR-csőbe töltve 24 μ L szeletelni a reakcióelegyet, plusz 1 μ L templát DNS-t, és végül adjunk hozzá 1 csepp ásványi olajat, hogy megakadályozzák a víz elpárolgása, Ezután kis centrifugálással.

(3) A PCR csöveket a PCR thermal cycler, indul a ciklus a következő eljárást:

(4) óvintézkedések

Mivel a PCR érzékenysége nagyon magas, ezért intézkedéseket kell tenni, hogy megakadályozzák a reakcióelegyből Trace DNS szennyeződést.

a. All PCR kapcsolatos reagensek, csak a PCR kísérletekhez, nem pedig annak célját.

b. műveletek használt PCR-csövek, centrifugacsőbe, osztályú pipetta csak egyszer használatos.

c. minden egyes plusz egy reagens, kap egy új csúcsot (fúvóka műanyag pipetta közismert).

3.. Kimutatása PCR termékek:

Agarose koncentráció (1,2%); EB koncentrációt (5 μ l / 100 ml TBE)

(1) ragasztó (például 150 ml)

a. Mérjünk 1,8 g agarózt, adjunk hozzá 150 ml TBE-pufferrel (pH = 8,0), rázott lombikok segítségével egy elektronikus mérleg, mondta a teljes súlyt.


Előző 1 Következő Válassza ki a Pages
Használó Felülvizsgálati
Nincs még hozzászólás
Én is kommentálom [Látogató (52.205.*.*) | Bejelentkezés ]

Nyelv :
| Ellenőrző kód :


Keresés

版权申明 | 隐私权政策 | Szerzői jog @2018 A világ enciklopédikus tudás